Storage and purification adaptations for the isolation of total RNA from the dura mater.

BACKGROUND: RNA extraction is a step that precedes several molecular techniques. The fibrous tissue, more specifically the dura mater, has several limitations in routine protocols, and lacks optimization protocols to overcome these problems. OBJECTIVE: To test stock reagents and purification kits, optimizing commercial kit protocols for RNA extraction from the dura mater. METHODS: Dura mater samples were obtained from eight Wistar rats and maintained in two different stabilizers. The samples were purified using four different protocols, and the RNA was evaluated for the yield and purity in NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). Beta-actin gene was used for analyzing gene expression, since is one of the most used reference genes. RESULTS: The RNA preservation was similar in both stabilizers. The addition of an incubation step prior the purification protocols allowed better tissue digestion and RNA recovery. The RNA purified using the protocols membrane-based showed higher quality than liquid-liquid purification. This impact was observed in the 3-week evaluation using RT-qPCR. CONCLUSION: Stabilizers are efficient for RNA preservation and membrane-based purification protocols are more suitable for RNA recovery from dura mater tissue, allowing the evaluation of gene expression in this type of tissue. Adaptations in the dura mater RNA extraction protocol differ from the pre-established protocols because it takes into account the peculiarity of fibrous tissue and low cellularity. In addition to providing a low-cost mechanism, based on techniques that are part of the laboratory routine, it is possible to improve the quality of the extracted material, ensuring greater efficiency in the use of subsequent techniques.

ANTECEDENTES: A extração de RNA é uma etapa que antecede várias técnicas moleculares. O tecido fibroso, mais especificamente a dura-máter, apresenta várias limitações nos protocolos de rotina e carece de protocolos de otimização para superar estes problemas. OBJETIVO: Testar reagentes de estoque e kits de purificação, otimizando protocolos de kits comerciais para extração de RNA da dura-máter. MéTODOS: Amostras de dura-máter foram obtidas de oito ratos Wistar e mantidas em dois estabilizadores diferentes. As amostras foram purificadas em quatro protocolos diferentes e o RNA foi avaliado quanto ao rendimento e pureza no NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). O gene da beta-actina foi utilizado para analisar a expressão gênica, uma vez que é um dos genes de referência mais utilizados. RESULTADOS: A preservação do RNA foi semelhante em ambos os estabilizadores. A adição de uma etapa de incubação antes dos protocolos de purificação permitiu uma melhor digestão do tecido e recuperação de RNA. O RNA purificado pelos protocolos baseados em membrana apresentou qualidade superior ao da purificação líquido-líquido. Este impacto foi observado na avaliação de três semanas usando RT-qPCR. CONCLUSãO: Os estabilizadores são eficientes para preservação do RNA e os protocolos de purificação baseados em membrana são mais adequados para recuperação de RNA do tecido da dura-máter, permitindo a avaliação da expressão gênica neste tipo de tecido. As adaptações no protocolo de extração de RNA da dura-máter diferem dos protocolos preestabelecidos porque leva em consideração a peculiaridade do tecido fibroso e com baixa celularidade. Além de fornecer um mecanismo de baixo custo, baseado em técnicas que fazem parte da rotina laboratorial, é possível melhorar a qualidade do material extraído, garantindo maior eficácia no uso de técnicas subsequentes.

Storage and purification adaptations for the isolation of total RNA from the dura mater / Adaptações no armazenamento e purificação para o isolamento de RNA total da dura-máter

Abstract Background RNA extraction is a step that precedes several molecular techniques. The fibrous tissue, more specifically the dura mater, has several limitations in routine protocols, and lacks optimization protocols to overcome these problems. Objective To test stock reagents and purification kits, optimizing commercial kit protocols for RNA extraction from the dura mater. Methods Dura mater samples were obtained from eight Wistar rats and maintained in two different stabilizers. The samples were purified using four different protocols, and the RNA was evaluated for the yield and purity in NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). Beta-actin gene was used for analyzing gene expression, since is one of the most used reference genes. Results The RNA preservation was similar in both stabilizers. The addition of an incubation step prior the purification protocols allowed better tissue digestion and RNA recovery. The RNA purified using the protocols membrane-based showed higher quality than liquid-liquid purification. This impact was observed in the 3-week evaluation using RT-qPCR. Conclusion Stabilizers are efficient for RNA preservation and membrane-based purification protocols are more suitable for RNA recovery from dura mater tissue, allowing the evaluation of gene expression in this type of tissue. Adaptations in the dura mater RNA extraction protocol differ from the pre-established protocols because it takes into account the peculiarity of fibrous tissue and low cellularity. In addition to providing a low-cost mechanism, based on techniques that are part of the laboratory routine, it is possible to improve the quality of the extracted material, ensuring greater efficiency in the use of subsequent techniques.

Resumo Antecedentes A extração de RNA é uma etapa que antecede várias técnicas moleculares. O tecido fibroso, mais especificamente a dura-máter, apresenta várias limitações nos protocolos de rotina e carece de protocolos de otimização para superar estes problemas. Objetivo Testar reagentes de estoque e kits de purificação, otimizando protocolos de kits comerciais para extração de RNA da dura-máter. Métodos Amostras de dura-máter foram obtidas de oito ratos Wistar e mantidas em dois estabilizadores diferentes. As amostras foram purificadas em quatro protocolos diferentes e o RNA foi avaliado quanto ao rendimento e pureza no NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). O gene da beta-actina foi utilizado para analisar a expressão gênica, uma vez que é um dos genes de referência mais utilizados. Resultados A preservação do RNA foi semelhante em ambos os estabilizadores. A adição de uma etapa de incubação antes dos protocolos de purificação permitiu uma melhor digestão do tecido e recuperação de RNA. O RNA purificado pelos protocolos baseados em membrana apresentou qualidade superior ao da purificação líquido-líquido. Este impacto foi observado na avaliação de três semanas usando RT-qPCR. Conclusão Os estabilizadores são eficientes para preservação do RNA e os protocolos de purificação baseados em membrana são mais adequados para recuperação de RNA do tecido da dura-máter, permitindo a avaliação da expressão gênica neste tipo de tecido. As adaptações no protocolo de extração de RNA da dura-máter diferem dos protocolos preestabelecidos porque leva em consideração a peculiaridade do tecido fibroso e com baixa celularidade. Além de fornecer um mecanismo de baixo custo, baseado em técnicas que fazem parte da rotina laboratorial, é possível melhorar a qualidade do material extraído, garantindo maior eficácia no uso de técnicas subsequentes.

The parietal foramen anatomy: studies using dry skulls, cadaver and in vivo MRI.

OBJECTIVE: The aim of this study was to describe the anatomical features encountered in the parietal foramen in a series of 178 human bones and 123 head MRI examinations. A cadaveric specimen was also dissected to demonstrate the trajectory of a superficial scalp vein through the parietal foramen as far as the dura mater. A literature review was performed regarding prevalence of parietal foramen in different populations. METHODS: Totally, 178 paired adult bones were used to investigate the presence, shape and number of the parietal foramina. In addition, 123 brain MRI examinations were also studied. RESULTS: The parietal foramina were encountered in 75/89 (84.3%) skulls [32/38 (84.2%) in women vs. 43/51 (84.3%) in men, p > 0.05]. The parietal foramen was present bilaterally in 44.73% of females and 54.9% of males. Regarding unilaterality of the parietal foramen, a right or left laterality was observed in female 21% right versus 18% left; and 16% versus 14% (left) in males (p > 0.05). The accessory parietal foramen was present in the right parietal in 2.6% and in 7.9% on the left side of the females, while 5.9% and 3.9% of the males on the right or left sides, respectively. The parietal foramina located in the proximity of the sagittal suture (male 7.1 ± 2.5 mm vs. female, 7.4 ± 2.7 mm). There was a positive correlation between the right and left parietal foramina regarding the distance from the median line. The distance from a foramen to the contralateral one was 16 ± 4 mm in men and 18 ± 5 mm in women, respectively (p > 0.05). CONCLUSION: No major differences were encountered between sexes regarding the anatomical features of parietal foramen.

Study on the development of frontal sinuses by morphometric analysis of the skull / Estudo referente ao desenvolvimento dos seios frontais pela análise morfométrica do crânio

The frontal sinuses are cranial areas of clinical, forensic and pathology importance whose development mechanisms are still poorly defined. Nasal airflow and brain development are two of the main theories. Current analysis debates whether they are the real determinants of frontal sinuses growth, which may be proved by the skull's morphometric analysis. Four groups of measures related to the external cranial architecture, the pyriform aperture, orbital cavities and frontal sinuses were defined. Thirty-three skulls of individuals, mean age 68 years, from the Laboratory of Anatomy of the Academic Centre of Victoria ­ UFPE ­ Brazil, were used. Statistical analysis showed total agenesis of the frontal sinus in 18.2% of the skulls. There was significant correlation between the development of the right frontal sinus and the pyriform aperture, and between the left frontal sinus and two cranial measurements (p ≤ 0.05). Significant differences between mean of pyriform aperture areas of the skulls with or without sinuses were also reported (p ≤ 0.01). Results supported the fact that there was a modulation activity by nasal aeration and brain formation in the development of frontal sinuses.

Os seios frontais são espaços cranianos de importância clínica, forense e patológica, cujos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento são ainda pouco definidos, sendo duas das teorias propostas, o fluxo aéreo nasal e o desenvolvimento encefálico. Objetivou-se evidenciar por meio de análise morfométrica do crânio se estes são os reais fatores determinantes do crescimento dos seios frontais. Neste estudo, foram definidos quatro grupos de medidas referentes à arquitetura craniana externa, à abertura piriforme, às cavidades orbitárias e aos seios frontais. Para este propósito, nós utilizamos 33 crânios de indivíduos com média de idade de 68 anos, provenientes do Laboratório de Anatomia Humana ­ Centro Acadêmico de Vitória- UFPE/Brasil. Após os exames estatísticos, foi verificado agenesia total dos seios frontais em 18,2 % dos crânios estudados. Houve correlação significativa entre o desenvolvimento do seio frontal direito e a abertura piriforme, e entre o do seio frontal esquerdo e duas aferições encefálicas, com p ≤ 0,05. Observamos uma diferença significativa entre as médias de áreas de abertura piriforme dos crânios que possuíam ou não os seios, com p ≤ 0,01. Os achados deste estudo comprovam o fato de que existe uma atividade moduladora exercida pela aeração nasal e formação encefálica no desenvolvimento dos seios frontais.